Metodología
La prueba qCOVID-19 RT-qPCR se ha desarrollado siguiendo los procedimientos e instrucciones de uso puestos a disposición de los laboratorios por el Center for Disease Control and Prevention de los EEUU (CDC-006-00019, Revisión: 03).
El ensayo se dirige a regiones de los genes de la nucleocápsida del virus (N1 y N2) y se compone de dos pasos principales: 1) extracción de los ácidos nucleicos de muestras de pacientes, y 2) transcripción reversa, amplificación por PCR con cebadores específicos y detección en tiempo real con sondas fluorescentes específicas del virus.
La retrotranscripción y amplificación se llevan a cabo en un único paso (single-step RT-PCR) utilizando el reactivo Thermofisher Scientific TaqPathTM 1-Step RT-qPCR Master Mix. Para garantizar la ausencia de inhibición de PCR, y la presencia de RNA, se incluye en cada análisis como control positivo interno la detección del gen RP humano.
Fig.1. Organización del genoma Sars-CoV-2; open reading frame (orf) 1a/b codificando proteinas no-estructurales para la replicación, proteinas estructurales incluyendo spike (S), envelope (E), membrana (M), nucleocápside (N) y proteinas accesorias (gris) como orf 3, 6, 7a, 7b, 8 and 9b.